Faktomluva o Covidu část druhá: jak spolehlivé jsou RT-PCR testy na Covid?

V minulé části cyklu Faktomluva o Covidu jsme se podívali na zoubek tomu, jak moc je Covid podobný běžné chřipce. Dnes se zastavme u toho, jak se onemocnění Covid vlastně diagnostikuje a nakolik všeobecně používaným testům můžeme věřit. Nejprve si rozebereme RT-PCR testy, v další části pak drobnohled obrátíme k testům antigenním.

I téma testů lidi rozděluje. Na jedné straně nás sdělovací prostředky i ministerstvo zdravotnictví ujišťují, že např. antigenní testy jsou vysoce spolehlivé a ti, kdo si věci do důsledků neověřují, nemají důvod o tom pochybovat. Na druhé straně jsou osobní zkušenosti, jako např. následující poměrně bizarní historka, kterou jsem si dnes vyslechl (a ano, může jít o hoax, to nezastírám):

Jeden známý mého známého—říkejme mu třeba pan Petr—byl vytrasován v chytré karanténě. I volá mu operátorka a že prý, jako potenciálně nakažený, musí na testy. A tak se objedná na test, dorazí na místo, stojí s ostatními nešťastníky ve frontě a trpělivě čeká, až se dostane na řadu. Najednou „cink“, přijde mu SMSka. I popatří na mobil a vidí SMS „Výsledek testu: jste pozitivní“. A to prosím, aniž by se vůbec k vlastnímu testu dostal!

Petr jde udiven jde domů a volá zpět milé operátorce z trasování. Paní si neoblomně trvá na svém: dostal jste zprávu, že jste pozitivní, tak jste sakra pozitivní. Nespokojený Petr, kterému se nechce být zbůhdarma v karanténě, si tedy zaplatí ze svého několik dalších testů. Výsledek? 3x negativní, 2x pozitivní. Žiju v demokracii, přemítá Petr, a tak na počet hlasů vyhrává verdikt „negativní“! Sbohem karanténo a hurá do práce.

Je jasné, že tohle člověku na důvěře ve výsledky testů zrovna nepřidá. A je irelevantní, jestli je to historka pravdivá nebo ne. Oleje do ohně nedůvěry přilil i známý parazitolog Flégr, stejně jako poměrně fundovaná analýza časopisu Echo. Situaci nepomohl ani rakouský poslanec Michael Schnedlitz, kterému vyšel pozitivní antigenní test namočený do Coca Coly.

Extrémní nedůvěra se pak projevuje v šíření poplašných zvěstí. U RT-PCR testů jsou například tyto zvěsti:

Použití vysokého počtu (60-65) amplifikačních cyklů v RT-PCR testech povede k pozitivnímu výsledku testu u kohokoliv. Test dávající negativní výsledek při 30 cyklech lze „překlopit“ na pozitivní prostým přidáním dalších cyklů.
Kary Mullis, vynálezce RT-PCR testu, se sám vehementně vyslovil proti tomu, aby byly RT-PCR testy používány k diagnostice infekčních onemocnění.

Pokusme si v tom tedy udělat jasno.

(doba čtení: 8:31)

Jaký je princip PCR testů?

Nejprve se pojďme podívat na princip toho, jak PCR testy fungují. Není potřeba chodit příliš do hloubky, postačí nám popis základních mechanismů. Poučení čtenáři mi prominou nevyhnutelná zjednodušení. Zdroje, ze kterých jsem čerpal, jsou zde, zde a zde.

Testované osobě se odebere vzorek genetického materiálu, nejčastěji výtěrem z nosohltanu (případně nosu, krku, úst apod. – tedy míst, kde je šance virus odhalit největší). Vzorek se vyčistí použitím různých chemických látek od „balastního“ materiálu, zejména bílkovin a tuků, až zbyde pouze genetický materiál, tj. DNA, RNA a případně messenger RNA (mRNA). Vyčištěný vzorek bude obsahovat genetický materiál testované osoby a—v případě, že je tato osoba infikovaná—i genetický materiál viru SARS-Cov-2.

Virus SARS-Cov-2 je — stejně jako spoustu dalších virů— tzv. RNA virus, tzn. že ve své struktuře obsahuje kyselinu ribonukleovou (RNA). Protože různé viry mají RNA různou, je možno specifické úseky RNA použít k detekci konkrétního viru. Takové úseky musí být ohraničeny tzv. primery (krátkými oligonukleotidy DNA).

Aby taková detekce byla spolehlivá, je třeba tento genetický materiál namnožit (amplifikovat). RNA samotná se však množit nedá, je tedy třeba ji napřed konvertovat na deoxiribonukeovou kyselinu, DNA. Za tímto účelem se vyčištěný vzorek podrobí procesu zvanému reverzní transkripce (reverze transcription).

Do vzorku se dále přidají krátké fragmenty jiné DNA, které budou použity ke zmiňovanému namnožení (nejčastěji termostabilní DNA polymeráza bakterie Thermus aquaticus). Takto upravený vzorek se poté vloží do RT-PCR testovacího kitu.

V testovacím kitu vzorek projde opakovanými cykly ohřívání a ochlazování. Tyto cykly spustí ve vzorku chemické reakce, díky kterým se začne virální DNA — je-li přítomna — replikovat (pro ty které to zajímá: ohřátí na 94-98°C způsobí rozrušení vodíkových můstků v DNA a tedy její „rozpletení“ na vlákna; ochlazení na 50-65°C zajistí nasednutí zvolených primerů na specifická místa DNA; další ohřátí na 75-80°C spustí syntézu DNA, při které dojde k vlastnímu množení virové RNA).

V každém cyklu dojde ke zdvojnásobení objemu testované virální DNA. Tedy po prvním cyklu budeme mít ve vzorku dvojnásobek původního množství virální DNA, po druhém čtyřnásobek, po desátém 1024-násobek a tak dále.

Detekce virové DNA je umožněna přítomností fluorescenčního substrátu, který se na ni váže. S tím jak ve vzorku přibývá virové DNA, zvyšuje se úroveň fluorescence (vzorek víc a víc světélkuje). Úroveň fluorescence je v testovacím kitu automaticky monitorována detektorem. Obvyklý průběh světelkování s rostoucím počtem amplifikačních cyklů je takovýto (zdroj):

Pokud je dosažena určitá prahová hodnota fluorescence, je test zastaven. Počet cyklů potřebných k prokazatelné identifikaci viru se pak nazývá práh cyklu (C_t – cycle threshold).

Už z tohoto popisu vyplývá, že nejde o nijak triviální operaci. V průběhu testu se používá řada pomocných chemikálií, vzorky musí být čištěny, promíchávány, nesmí dojít k jejich kontaminaci, apod. Komplikace mohou být v zásadě trojí:

Nepřesně připravená PCR reakce. Jde o problémy působené běžnou lidskou chybovostí, jako je nepřesné pipetování, špatné promíchání apod.
Nekvalita základního vzorku. Virová RNA ve vzorku může být „nekvalitní“, tzv. degradovaná. Vzorek může být kontaminován např. tak, že se odběrová tyčinka mimoděk dotkne rukavice zdravotního pracovníka. Dalším faktorem je, v jaké fázi progrese nemoci byl vzorek sebrán; vzorek sebraný brzy po nákaze se může dramaticky lišit od vzorku sebraného v akutní fázi. A konečně může být vzorek znehodnocen nevhodnou dopravou a skladováním.
Objektivní vlastnosti testu samotného. Je zřejmé, že testy mají mnoho stupňů volnosti. Záleží na vybraných úsecích RNA sloužící k detekci viru, zvolených primerech, výběru pomocné DNA polymerázy a na dalších použitých látkách. Samotné množení RNA pomocí DNA polymerázy je zatíženo mutacemi, a tedy generuje chyby samo o sobě. Při nevhodně zvolených detekovaných úsecích virální RNA, může být test znehodnocen tzv. cross-reaktivitou, tedy tím, že dojde k mylné detekci podobné RNA zcela jiného viru. Použité chemikálie mohou znehodnotit kvalitu PCR reakce díky zbytkové přítomnosti tzv. inhibitorů nebo enhancerů. Že výrobní kvalita testů není u všech výrobců zdaleka stejná, dokumentuje třeba známý skandál s nekvalitními testy z Číny.

V praxi se chybovost testů snižuje tím, že se jeden vzorek testuje paralelně třikrát. Výsledek testu se pak určuje ze všech tří dílčích testů (tedy ze tří nezávislých hodnot C_t). Jsou-li rozdíly v dílčích testech velké, je test jako celek považován za neprůkazný.

Jak se stanoví konečný verdikt testu, tj. pozitivní vs. negativní?

No a jak se tedy dojde ke konečnému verdiktu, tedy závěru, zda je testovaný pozitivní nebo negativní? Různí výrobci a různé laboratoře si práh citlivosti, při jehož překročení C_t považují test za pozitivní, stanovují různě. Situace je navíc dále komplikována tím, že pokud test testuje více specifických úseků RNA najednou, práh citlivosti nemusí být pro všechny tyto úseky stejný. Pak je potřeba výsledky nějak agregovat. Každý výrobce tedy musí svůj test nějak specificky kalibrovat, což znamená, že testy od různých výrobců jsou navzájem velmi obtížně srovnatelné.

Díky různé povaze různých testů pro práh citlivosti neexistuje žádný „zlatý standard“. K nějakému konsensu by mohly pomoci výzkumy zaměřené na to, jaké hodnoty prahu citlivosti jsou „nejpraktičtější“ z politického a společenského hlediska. Tedy jaký práh citlivosti zvolit, aby

RT-PCR testy nebyly příliš citlivé, tedy nevedly k velkému počtu lidí, kteří jsou diagnostikováni jako pozitivní, aniž by zároveň byli nakažliví nebo symptomatičtí
RT-PCR testy nebyly příliš necitlivé, tedy nevedly k velkému počtu lidí, kteří jsou diagnostikování jako negativní, a přitom by mohli někoho nakazit anebo by sami mohli vážně ochořet

K tomu je dobré zkoumat korelace mezi C_t a nakažlivostí (infectivity) nebo vážností nemoci (severity). Takovéto klinické výzkumy stále probíhají, v současnosti dostupné výsledky shrnuje např. tato metastudie. V obecnosti je možno říci, že nižší hodnoty C_tjsou asociovány s vyšší nakažlivostí, horším průběhem nemoci a fatálnějšími důsledky.

Jelikož obě zmíněná kritéria pro volbu prahu citlivosti jsou proti sobě, je každá taková volba nelehkým kompromisem možného. Obojí najednou prostě zajistit nelze.

Detaily ke schváleným testům v různých zemích uvádějí např. protokoly WHO. Nahrubo je možno říci, že práh citlivosti pro C_t se obvykle pohybuje mezi 35 a 40 (to mimochodem znamená, že v průběhu typického testu dojde k namnožení původního virového materiálu v řádu desítek až tisíců milliard – sic!).

V praxi je situace dále komplikovaná tím, že testovací laboratoře obecně nereportují výsledné hodnoty C_t. Problematické je dokonce i dohledání toho, jaký konkrétní RT-PCR test ta která laboratoř používá (prozkoumal jsem namátkou několik testovacích laboratoří ze seznamu ministerstva zdravotnictví, a detaily k použitým testům jsem nenašel ani u jedné z nich).

Jaké testy jsou používány v ČR?

Nejsem si vědom toho, že by existoval kompletní seznam RT-PCR testů na SARS-Cov-2 certifikovaných pro použití v ČR. Pokud o něm někdo víte, budu vděčný za doplnění.

Spíše to vypadá na to, že různé testovací laboratoře používají různé sady testů od různých výrobců. Určitým vodítkem mohou být seznamy dovozců zdravotnického materiálu, které testovací laboratoře zásobují. Například distributor medicinských testů firma Biovendor dováží do ČR šest testů od výrobců z Číny, Francie, Itálie, Velké Británie, Austrálie a Německa.

Existují i RT-PCR testy vyráběné v Česku, např. velmi kvalitní test od firmy GeneProof. Nelze zjistit, jak moc je v ČR využíván tento konkrétní test.

Tato situace činí testování dost nepřehledným. Zdánlivě jeden a tentýž typ testu aplikovaný různými laboratořemi může vést k různým výsledkům.

Jak lze tedy shrnout objektivní danosti PCR testů?

PCR testy testují pouze a jen přítomnost vybraných fragmentů RNA viru ve výtěru. Nejde v žádném případě o testy nemocnosti (testovaný může být zcela asymptotický), ani nakažlivosti (testovaný nemusí být šiřitelem onemocnění Covid-19). Testy mohou vyjít pozitivně
- lidem aktuálně nemocným (symptomatickým) a infekčním
- lidem, kteří nemoc prodělali, byli symptomatičtí, ale dnes jsou již bez příznaků
- lidem, kteří žádné subjektivní potíže nemají ani nikdy neměli a vůbec si nejsou vědomi, že by kdy byli nakaženi

Je jasné, že označovat tuto nesourodou skupinu lidí jako „nakažení“ je zavádějící, i když pochopitelné. V praxi by šlo tento problém zmírnit tím, že by se namísto verdiktu pozitivní/negativní publikovalo i dosažené skóre C_t. Nevýhodou by bylo ještě větší matení už tak zmatené veřejnosti 😉

Pozitivní výsledek PCR testu absolutně nevypovídá o tom, kolik viru v sobě testovaný má („virus load“). Odhlédněme pro zjednodušení od nepřesností způsobených sběrem vzorků (i dva lidé, se stejným množstvím viru v krvi, mohou mít různé bazální množství viru ve výtěru v nosohltanu, protože onemocnění u nich může mít různý průběh a virus může být po jejich těle různě distribuován). Představme si dva lidi, z nichž jednomu test „zablikal“ při C_t=10 a druhému při C_t=25. Oba jsou pozitivní a musí být v karanténě, ale přitom se liší v množství viru ve vzorku 32768-krát!
Není příliš pravděpodobné, i když to nelze vyloučit, že by PCR test vyšel pozitivní někomu, kdo se s virem SARS-Covid-19 nikdy nesetkal. I když amplifikační cykly vnáší do testu značnou nepřesnost, ani ony nedokáží „vyrobit něco z ničeho“. Teoreticky není možné, aby někomu zcela bez viru SARS-Covid-19 vyšel test pozitivní. Prakticky je tato možnost otevřena díky kontaminaci z jiného vzorku, záměně vzorků dvou pacientů nebo výše zmíněné cross-reaktivitě (tedy tomu, že test chybně detekuje fragmenty RNA jiného viru, než je SARS-Cov-2). Že to v praxi nelze plně vyloučit, dokumentuje i srovnávací studie několika komerčně používaných testů, kde se uvádí, že až 4,1% testů různých výrobců vyšlo pozitivně i když žádný SARS-Cov-2 neobsahovaly (Mimochodem tato studie jako jedna z mála pracuje s uměle vytvořenými vzorky obsahujícími přesně definované fragmenty viru v přesně definovaných koncentracích. Její její vypovídací schopnost je proto velmi vysoká a procento falešně pozitivních velmi přesné).
PCR testy od různých výrobců mezi sebou nejsou navzájem dobře srovnatelné a mohou dávat velmi rozdílné výsledky. Vedlejším důsledkem této skutečnosti je i to, že mezinárodní srovnání počtů „nakažených“ mohou být, díky různým testům, zavádějící.
PCR testy jsou vysoce senzitivní, dle některých zdrojů až příliš. Mnozí výzkumníci považují práh citlivosti blížící se 40 za přehnaný. Argumentují tím, že takto citlivé testy detekují i zbytkové genetické fragmenty, které nepředstavují žádné reálné riziko (ala jeden nalezený vlas v místnosti, zbylý po osobě, která již dávno odešla), a doporučují práh citlivosti snížit na 30 i méně. Tentýž zdroj uvádí, že až 90% pozitivně testovaných ve třech amerických městech nemělo v sobě skoro žádný virus.
PCR testy mohou být velmi zavádějící, pokud jsou použity příliš brzo po nákaze nebo na zdravou (asymptotickou) populaci. Pak může být počet tzv. falešně pozitivních velmi vysoký.

Co řekl o PCR testech jejich vynálezce, Dr. Kary Mullis

Dr. Kary Mullis, který za vynález PCR testů obdržel Nobelovu cenu, je poněkud kontroverzní osobou. V posledních letech před svojí smrtí se vymezoval vůči převládajícímu názoru, že onemocnění AIDS je způsobeno virem HIV. Některá jeho vyjádření k PCR testům je dobré chápat v tomto kontextu. Podkladem pro různé místy až konspirační vyjádření Mullisovi připisované je pravděpodobně jeho následující výrok, uvedený zde:

Quantitative PCR is an oxymoron. PCR is intended to identify substances qualitatively, but by its very nature is unsuited for estimating numbers. Although there is a common misimpression that the viral load tests actually count the number of viruses in the blood, these tests cannot detect free, infectious viruses at all; they can only detect proteins that are believed, in some cases wrongly, to be unique to HIV. The tests can detect genetic sequences of viruses, but not viruses themselves.

Nepřijde mi, že by tento výrok nějak vybočoval z toho, co jsme si o PCR testech řekli. Nechám čtenáře, aby si názor udělali sami. Pro úplnost je třeba dodat, že mnoho fake news odvolávajících se na Kary Mullise mu ve skutečnosti připisuje výroky, kterých se nedopustil. Některé takové případy se rozebírají např. zde.

Jak je to s poplašnými zprávami o PCR testech?

Z výše uvedeného už by mělo být zřejmé, jak je to s dalšími poplašnými zprávami o RT-PCR testech. Ano, je bez problémů možné mít dva testy s různými výsledky (i mezi známými mých známých takové případy jsou). Použití vysokého počtu amplifikačních cyklů (nad 40) sice nemůže vést k pozitivnímu testu u každého, ale dramaticky zvyšuje šanci, že jako pozitivní vyjdou i lidé bez jakýchkoliv zdravotních problémů představující nulové společenské riziko. Většina testů ovšem takto vysoké počty amplifikačních cyklů nepoužívá; i tak je ovšem jejich citlivost možná až příliš vysoká. Testy neprobíhají tím stylem, že by se amplifikační cykly libovolně přidávaly, dokud není dosaženo pozitivního výsledku. Vyjádření, že test, který je „negativní“ při 25 cyklech, může být „pozitivní“ při např. 40 cyklech, je nepřesné — pozitivita testu se odvíjí od počtu cyklů nutného k dosažení prahu citlivosti a dokud není tohoto prahu dosaženo, test není ani pozitivní, ani negativní, ale neukončený.

Závěr

RT-PCR test je klasickým příkladem poměrně složité chemické procedury, jejíž výsledek a výklad se v médiích silně zjednodušuje. Navíc nejde o jeden test, ale o baterii mnoha testů od různých výrobců, které jsou sice založeny na stejném principu, ale dávají různé, nepříliš dobře porovnatelné výsledky. Hlavní nevýhodou RT-PCR testu je vysoká citlivost vedoucí v praxi k velkému počtu tzv. falešně pozitivních (tj. lidí s pozitivním výsledkem testu, avšak nenakažlivých a bez jakýchkoliv známek onemocnění). To významně snižuje vhodnost RT-PCR k plošnému testování zdravé populace. K problematice použití RT-PCR testů při masivním testování se ještě vrátím v dalším článku.